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GBT18204.10-2000 游泳池水微生物檢驗方法大腸菌群測定

[2022-03-16 15:54:51]

GBT18204.10-2000 游泳池水微生物檢驗方法大腸菌群測定.pdf


1范圍

本標準規(guī)定了游泳池水大腸菌群的測定方法。

本標準適用于游泳池水大腸茵群的測定。

2引用標準

下列標準所包含的條文,通過在本標準中引用而構(gòu)成為本標準的條文。本標準出版時,所示版本均為有效。所有標準都會被修訂,使用本標準的各方應(yīng)探討使用下列標準最新版本的可能性。

GB/T 18204. 2- 2000 公共 場所茶具微生物檢驗方法大腸菌群測定

3定義

本標準采用下列定義。

大腸菌群coliform bacteria

指一群在36'C士1C培養(yǎng)24 h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

第一法多管發(fā)酵 法.

4儀器

見GB/T 18204. 2--2000中第3章。

5培養(yǎng)基和試劑

5.1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

5.1.1 成分:蛋白胨                               10 g

牛肉膏                                           3g

乳糖                                               5g

氯化鈉                                           5g

1.6%(V/V)溴甲酚紫乙醇溶液                         1 mL

蒸餾水                                           1000 mL

5.1.2 配法:將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置于1 000 mL蒸餾水中加熱溶解,調(diào)pH到7.2~7.4。

5.1.2 配法:將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置于1 000 mL蒸餾水中加熱溶解,調(diào)pH到7.2~7.4。

再加入1 mL1. 6%溴甲酚指示劑,充分混勻,分裝到含有倒管的試管中,115C高壓滅菌15 min.

5.2 伊紅美蘭瓊脂

見GB/T18204.3~-2000中第4章第2節(jié)。

5.3 革蘭氏染色液

見GB/T 18204.3- 2000中第4章第4節(jié)。

5.4染色法

見GB/T 18204.3- -2000 中第4章第5節(jié)。

6推測性試驗

6.1在2個裝有50mL三倍濃縮乳糖膽鹽培養(yǎng)液的大試管或燒杯內(nèi)各加入水樣100mL.

6.2在10支裝有5mL三倍濃縮乳糖膽鹽培養(yǎng)液的試管里各加入水樣10mL。

6.3輕搖試管,使液體充分混勻,置 36"C士1C培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。

6.4觀察每管是否產(chǎn)氣,如不產(chǎn)氣則報告為大腸茵群陰性;若有氣體產(chǎn)生則為推測性試驗陽性,需做進--步的證實試驗。

7證實試驗

7.1平板分離

自推測性檢驗陽性管中取一接種環(huán)培養(yǎng)液,接種到伊紅美藍瓊脂平板上,置36'C土1C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24h,觀察菌落形態(tài),典型的大腸菌群菌落為黑紫色或紅紫色,具有金屬光澤。

7.2復發(fā)酵試驗挑取可疑大腸菌群菌落1或2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發(fā)酵管,于36"C士+1C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h.

7.3凡乳糖 發(fā)酵管最終產(chǎn)酸、產(chǎn)氣,革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,為大腸菌群陽性。記下證實試驗的陽性管數(shù),查總大腸菌群(MPN)檢索表得出1000mL水樣中總大腸菌群的MPN值。

表1總大腸菌群(MPN)檢索表

第二法濾膜法

8儀器

8.1 濾器。

8.2 濾膜;孔徑0.45 um。直徑根據(jù)濾器規(guī)格,目前常用的有35 mm和47 mm兩種。

8.3抽濾設(shè) 備。

8.4無齒鑷子。

8.5 其他儀器見GB/T 18204.2--2000中第3章。

9培養(yǎng)基

9.1品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基

9.1.1 成分:

蛋白胨                                     10g

酵母浸膏                                  5g

牛肉膏                                     5g

乳糖                                         10g

瓊脂                                        10-20g

磷酸氫二鉀                              3.5g

無水亞硫酸鈉                           5g

5%堿性品紅乙醇溶液20 mL

蒸餾水                                      1000ml

9.1.2儲備培養(yǎng)基的制備

將磷酸氫二鉀、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900 mL蒸餾水的燒杯中,溶解后調(diào)pH值到

7. 2~7.4,加人瓊脂加熱溶解,用蒸餾水補足至1 000 mL,趁熱用脫脂棉或絨布過濾,再加人乳糖,混勻

9.1.3平皿培養(yǎng)基的制備

9.1.3平皿培養(yǎng)基的制備

將上述培養(yǎng)基加熱融化,根據(jù)培養(yǎng)基的用量,堿性品紅乙醇溶液與培養(yǎng)基按1↑50的比例,用滅菌另一個滅蔭空試管內(nèi).加滅菌水少許使其溶解,在沸水浴中煮沸滅菌10 min。另一個滅蔭空試管內(nèi).加用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液,滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色褪成淡粉紅色為止。將滅菌水少許使其溶解,在沸水浴中煮沸滅菌10 min。

此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加入已融化的儲備培養(yǎng)基中,并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡),立即將此種培養(yǎng)基適量傾人滅菌的空平皿內(nèi),待其冷卻凝固后置冰箱內(nèi)備用。此培養(yǎng)基于冰箱中保存不宜超過兩周，如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色,則不能再用。

9.2乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

10 操作步驟

10.1濾膜滅 菌:將濾膜放人含蒸餾水的燒杯中,煮沸滅菌三次,每次15 min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2~3次,以除去殘留溶劑。

10.2 濾器滅菌:用121C商壓滅菌20 min或用點燃的酒精棉球火焰滅菌。

10.3 水樣過濾:用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分,將粗糙面向上,貼放在濾床上。固定好濾器,將X10' Pa(-0.5大氣壓)下抽濾。X10' Pa(-0.5大氣壓)下抽濾。

10.4 培養(yǎng):水樣濾完后,再抽氣約5s,關(guān)上濾器閥門,取下濾器。用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分,移放在乳糖瓊脂分離培養(yǎng)基上,濾膜截留細菌面向上,濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊,兩者之間不得留有氣泡。然后將平皿倒置,放人36C士1C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18~24 h.

10.5挑取濾膜上符合下列特征的茵落進行革蘭氏染色、鏡檢。

紫紅色,具有金屬光澤的菌落;

深紅色,不帶或略帶金屬光澤的菌落;

淡紅色,中心色較深的菌落。

10.6 將革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌接種到乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中.于36C士1C培養(yǎng)48h.產(chǎn)酸產(chǎn)氣者證實為大腸菌群陽性。

11 檢驗結(jié)果報告

計算濾膜上生長的證實為大腸菌樣的菌落數(shù),再乘以10即為每1000mL水樣中的大腸菌群數(shù)。

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